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Parasitologie

Travaux Pratiques de Parasitologie Générale

Diagnostic des parasitoses par la technique de flottaison

capilaire.JPG

Objectifs : à la fin de cette manipulation, chaque étudiant devra être capable de :

- maitriser les techniques de flottaison ;

- rechercher les formes pré-imaginales d’helminthes et d’ookystes coccidiens ;

- décrire la morphologie externe et identifier les éléments parasitaires observés

Technique de l’examen coprologique

a-      L’examen macroscopique

II faut noter la couleur et la consistance de la selle/ ainsi que la présence éventuelle de sang, de glaires, de mucosités et de pus.  Sur des selles moulées ou pâteuses, on recherchera particulièrement les œufs d’helminthes et les kystes de protozoaires.

Sur des selles molles, diarrhéiques ou muco-sanguinolantes, on s’attachera à rechercher avant tout les formes végétatives des protozoaires. L’examen macroscopique permet de déceler certains parasites sous forme adulte tel que : des anneaux de Ténia, des vers d’Ascaris, d’Oxyure, de Trichocéphale, d’Ankylostome ou autres dont l’identification sera confirmée par l’examen microscopique, au besoin après éclaircissement à l’acide acétique.

Ce procédé est particulièrement indiqué pour  l’examen des cestodes dont les téguments sont riches en calcaire. Après un séjour de 2 heures dans l’acide acétique pur, on écrase légèrement le parasite entre 2 lames. Il devient transparent et permet l’étude de son anatomie ce qui facilite le diagnostic d’espèce.

b-     L’examen microscopique

II recherche les œufs et larves d’helminthes, les formes végétatives et kystiques des protozoaires (ookystes coccidiens) Il signale aussi la présence de leucocytes, d’hématies, d’éléments fongiques;

de cristaux et de résidus alimentaires dans la selle. L’examen microscopique comporte soit un examen direct et/ou des techniques d’enrichissement.

L’examen direct

C’est le procédé le plus simple, le plus rapide et le moins couteux qui permet d’observer les parasites dans les selles. Il montre aussi la mobilité des formes végétatives des protozoaires.

(Il comporte deux préparations, la première à l’eau physiologique et la deuxième au lugol.

Examen direct à l’eau physiologique

Prélever, à l’aide d’un agitateur/ une petite parcelle de matière fécale et l’étaler dans une goutte de sérum physiologique, sur une lame qu’on recouvrira d’une lamelle. La préparation doit être mince et examinée en entier ; tout d’abord au grossissement (obj x 10), une fois les éléments parasitaires suspects repérés on les confirme au grossissement (obj x 40).

Examen direct au lugol

II suit les mêmes modalités que précédemment sauf que la goutte d’eau physiologique est remplacée par une goutte de lugol.

• Lugol :    Iode 1 g et lodure de potassium    2 g)

Technique de flottation

La flottaison est la technique d’enrichissement la plus utilisée en Médecine Vétérinaire et Humaine. Elle a pour objectif de concentrer les éléments parasitaires à partir d’une très petite quantité de déjections. Elle repose sur l’utilisation de solutions dont la densité est supérieure à celle de la plupart des œufs de parasites (d = 1,1 à 1,2). Le but est de faire remonter les éléments parasitaires tout en laissant couler les débris fécaux.

Quelques exemples de solutions de flottation

solutions Avantages

Inconvénients

Préparation

Sulfate de zinc à 33%
d = 1,18

- Concentre très bien les kystes de Giardia - Remontée importante de débris
- Stimulation importante des larves (perturbe beaucoup la lecture)
- 371 g de ZnSO4
- eau qsp 1000 ml

Sulfate de zinc modifié
d = 1, 44

- Pas polluant - Remontée importante de débris
- Stimulation importante des larves (perturbe beaucoup la lecture)
- 330 g de ZnSO4
- 150 g d’acétate de zinc
- eau qsp 1000 ml

Chlorure de sodium
d = 1,18 à 1,2

- Très peu coûteux
- Facile à préparer
- Corrosif
- Remonte presque uniquement les kystes de coccidies
- Tendance à former des cristaux
- Déformation importante des œufs
- 400 g de sel de cuisine
- eau qsp 1000 ml

Remarque : d = densité      qsp : quantité suffisante pour

Matériel de laboratoire

- Microscope muni des objectifs : x4, x10, x40 ;

- Lames porte objet et lamelles couvre objet ;

- Solutions de densités différentes ;

- Pipettes et verrerie graduées ;

- Erlen Meyer en plastique ou à défaut en verre.

- Agitateurs de verre ou spatules de bois.

- Tubes à essais.

- Pilon et mortier.

- une balance.

Matériel facultatif

- Centrifugeuse.

- Oculaire micrométrique ;

- Objectif x100 à immersion pour l’identification de certains Protozoaires.

À apporter par les étudiants

-          Blouse blanche et chaussures fermées ;

-          Une paire de gants pour chaque sous-groupe ;

-          Boîtes et spatule de bois, bambou ou autres ;

-          06 Passoires à thé (mailles d’environ 0.5 mm de diamètre) pour tout.

-          15g de fèces d’animaux domestiques dans un flacon en plastique hermétiquement clos ;

-          Sel de cuisine (2kg en tout pour tous les groupes) ;

-          01 litre d’eau de javel pour tous les groupes ;

-          02 rouleaux de papier hygiénique par groupe ;

-          Désodorisant.

 Mode opératoire

1.      Réaliser l’inspection macroscopique du prélèvement (consistance, muqueuses, sang, pus,

2.    Homogénéiser le prélèvement au moyen d’un mortier et d’un pilon (humidifier si les fèces sont trop sèches, mais l’analyse quantitative ne sera plus possible).

3.     Peser 5 grammes de matières fécales recueillies avec la pointe d’un bistouri ou autres objets stériles en divers points du prélèvement.

4.      Les placer dans un récipient gradué en plastique.

5.      Ajouter 20 ml d’une solution de flottation.

6.      Délayer soigneusement le mélange de façon à obtenir une solution homogène.

7.    Filtrer le mélange sur une passoire à thé sous laquelle on a pris soin de déposer un récipient en plastique. Cette étape sera renouvelée lors de l’analyse de fèces des petits ruminants.

8.      Remplir complètement un tube à centrifugation (ou à défaut un tube à essai) avec le liquide filtré jusqu’à formation d’un ménisque convexe.

9.      Crever les bulles d’air à la surface s’il y a lieu.

10.  Recouvrir le ménisque d’une lamelle sans emprisonner de bulles d’air.

11.  Attendre 15 à 20 minutes la remontée des œufs par ascension

12.  Retirer la lamelle à la face inférieure de laquelle se sont accumulés les œufs.

13.  Poser la face inférieure de cette lamelle sur une lame porte objet.

14.  Observer au microscope et décrivez (forme, couleur, répartition du contenu, présence de larve ou pas) et, identifier les éléments parasitaires.

Règles générales de l’examen microscopique

La recherche des œufs ou de larves d’helminthes se fait à l’aide de l’objectif x4 puis x10. Pour l’identification de ces éléments, on pourra avoir besoin de l’objectif x40.

En ce qui concerne la recherche des kystes de protozoaires, l’utilisation d’un objectif x40 est conseillée d’emblée. L’identification de ces kystes passera par l’utilisation de l’objectif x40 voire de l’objectif à immersion pour obtenir une image fine du kyste observé.

La surface de la préparation sera systématiquement et rationnellement explorée, pour ne laisser aucun point échapper à l’examen.

Technique d’observation de l’échantillon au microscope.

L’identification des éléments parasitaires se fait sur des critères morphologiques qui sont les suivants :

- La nature de l’élément parasitaire : œuf ou larve.

- La présence d’éléments caractéristiques : opercule, bouchons polaires, crochets.

- La forme : rond, ovale, allongé, forme des pôles…

- Le contenu : cellule unique, morula, larve.

- La paroi : fine ou épaisse, lisse ou irrégulière, piquetée ou striée.

- La couleur.

- La taille : appréciée à l’oculaire micrométrique.

Compte rendu à faire

Titre :

Objectif :

Principe :

Méthodologie :

Résultats :

Interprétation :

Conclusion :

Quizz

1-      Quels sont les éléments parasitaires pouvant être observés par la technique de flottaison ?

2-      Quel sont les types d’examen pouvant être fait sur un échantillon de fèces ?

3-      Que peuvent révéler l’analyse des selles d’un patient souffrant  d’ascaridiose aigüe?

4-      Citer 04 éléments pouvant vous aider à attribuer un œuf observé à un parasite gastro-intestinal.

5-      Quel type d’examen peut-il révéler la présence des proglottis ?

6-      A quel stades peuvent correspondre les éléments parasitaires retrouvés dans les fèces ?

7-      Quels sont les formes et les types de contenu des œufs pouvant différencier les espèces parasitaires ?

8-      Pourquoi faut-il attendre 15 à 20 min après avoir versé le filtrat dans le tube à essai ?

9-      Quel est l’importance d’homogénéiser la matière fécale avant de peser la quantité à analyser ?

10-  Quelle quantité de sel faut-il pour préparer 7 litres de litres de solution de flottaison ?

Quelques techniques en vidéos

Photos

paras.JPG

tenia.JPG

Cycle de vie du ténia

ecto.JPG

Une puce (ectoparasite)

ascaris.JPG

Ascarie



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